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| La edición del genoma dirigida a un gen responsable de la fabricación de pigmentos corporales dio lugar a crías albinas, lo que sugiere que la ingeniería genética tuvo éxito en los marsupiales. Crédito: RIKEN |
Interrupción genética dirigida en un marsupial, Monodelphis domestica, mediante la edición del genoma con CRISPR/Cas9
Resumen
Los marsupiales representan una de las tres subclases de mamíferos existentes con características muy singulares que no comparten otros mamíferos. En particular, gran parte del desarrollo de los neonatos nacidos inmaduros tras una gestación relativamente corta tiene lugar en el medio ambiente exterior. Entre los marsupiales, la zarigüeya gris de cola corta (Monodelphis domestica; en adelante "la zarigüeya") es uno de los pocos modelos de laboratorio establecidos. Debido a muchas características biológicamente únicas y a sus ventajas experimentales, la zarigüeya se utiliza como especie prototipo para la investigación básica de la biología de los marsupiales.
Sin embargo, los estudios in vivo de la función génica en la zarigüeya, y por tanto en los marsupiales en general, están muy por detrás de los de los mamíferos euterios debido a la falta de medios fiables para manipular sus genomas. En este estudio, describimos la generación exitosa de zarigüeyas con genoma editado mediante una combinación de metodologías refinadas en biología reproductiva y manipulación de embriones. Aprovechamos el parecido de la zarigüeya con modelos de roedores populares, como el ratón y la rata, en cuanto a tamaño corporal y características de reproducción. En primer lugar, establecimos un conjunto de tecnologías reproductivas, desde la inducción de la ovulación, la cópula cronometrada y la recogida de cigotos hasta la transferencia de embriones a hembras pseudopreñadas, que garantizan una plataforma esencial para la manipulación de cigotos de zarigüeya. Además, hemos demostrado con éxito la generación de zarigüeyas con genes knockout en el locus Tyr mediante la microinyección de cigotos en fase pronuclear utilizando la edición del genoma CRISPR/Cas9, junto con la transmisión de la línea germinal de los alelos editados a la generación F1. Este estudio proporciona una base crítica para los lugares donde se expande la genética inversa de los mamíferos en la subclase de los metaterios.
Investigadores del Centro de Investigación de la Dinámica de los Biosistemas (BDR) de RIKEN han conseguido crear el primer marsupial modificado genéticamente. Este estudio, publicado en la revista científica Current Biology, contribuirá a descifrar el trasfondo genético de las características únicas observadas únicamente en los marsupiales.
Los animales modificados genéticamente, sobre todo los ratones y las ratas, son herramientas muy importantes para investigar procesos biológicos. Por ejemplo, los investigadores suelen silenciar genes para averiguar cuáles son sus funciones normales. Como los marsupiales tienen características únicas, su estudio requiere el desarrollo de un modelo animal representativo. Hasta la fecha, la mejor opción es la zarigüeya, que se cree que es el ancestro de todos los marsupiales. La zarigüeya, el primer marsupial del que se ha secuenciado su genoma completo, es un buen animal modelo porque su tamaño y sus características de reproducción son similares a las de los ratones y las ratas.
Al igual que otros marsupiales, la zarigüeya tiene una serie de características que no se encuentran en otros mamíferos. Se desarrolla sin una placenta funcional y las crías nacen prematuramente. Al igual que los humanos, pero no otros mamíferos no marsupiales, contrae cáncer de piel por la simple exposición a la luz ultravioleta. También, a diferencia de otros mamíferos, las crías de zarigüeya recién nacidas con lesiones en la médula espinal tienen la capacidad de curarse de forma natural. Debido a estas características únicas, el estudio de la biología de los marsupiales está ganando interés. Sin embargo, ha sido difícil analizar su genética subyacente sin una tecnología establecida para modificar genéticamente a los marsupiales. Ahora, un equipo de investigación dirigido por Hiroshi Kiyonari en el RIKEN BDR está aprovechando la nueva tecnología de edición de genes para poner en marcha la investigación de las zarigüeyas.
La edición del genoma requiere la recogida sistemática de huevos fecundados, ya que la solución para la edición del genoma se inyecta en los huevos fecundados. Dado que las zarigüeyas tienen un largo ciclo de celo y un fuerte sentido de la territorialidad, una pareja tarda aproximadamente una semana en aparearse aunque vivan juntas, lo que dificulta la realización del experimento de forma sistemática. El equipo de investigación administró una hormona utilizada en ratones y otros animales de laboratorio para estimular el celo en las hembras, y consiguió acortar considerablemente el tiempo necesario para el apareamiento.
Para generar un óvulo fecundado editado genéticamente es necesario trasplantar el embrión a una madre de alquiler. Como se hace en ratones y ratas, los investigadores transfirieron el óvulo fecundado al útero de una zarigüeya hembra fértil, y obtuvieron con éxito crías. Este es el primer caso en que la tecnología de transferencia de embriones se establece en marsupiales.
Normalmente, la solución necesaria para la edición del genoma se inyecta en el óvulo fecundado mediante una fina aguja. Sin embargo, como el óvulo fecundado de la zarigüeya está rodeado por una gruesa capa de proteínas y una estructura dura parecida a un caparazón, la aguja de inyección no puede penetrarlo. "Uno de los trucos de nuestro éxito", explica Kiyonari, "fue utilizar un elemento piezoelectrónico junto con la aguja, que permitió que ésta penetrara en la dura capa de cáscara y en la gruesa capa que rodea al óvulo. Así, el piezoeléctrico permitió inyectar cigotos sin daños significativos".
Para confirmar la metodología general, los investigadores se dirigieron a un gen responsable de la fabricación de pigmentos corporales. Cuando este gen se interrumpe, no se puede producir el pigmento y la piel carece de color. Algunas de las crías obtenidas en este experimento eran albinas, y sus genes fueron heredados por la siguiente generación, por lo que esto representa el primer éxito en la edición de genes en marsupiales.
Ahora que el proceso se ha establecido, los investigadores pueden centrarse en responder a todas sus preguntas sobre la biología de los marsupiales. "Los marsupiales representan una de las tres subclases de mamíferos existentes con una serie de características únicas que no comparten otros mamíferos. Una vez establecida la tecnología en este experimento de prueba de concepto, los estudios futuros pueden crear marsupiales modificados genéticamente que tendrán un impacto en los campos de la embriología de los mamíferos, la impresión genómica, la reproducción, la neurobiología, la inmunogenética, la biología del cáncer e incluso la evolución comparativa", afirma Kiyonari.
Fuentes, créditos y referencias:
Referencia: "Targeted gene disruption in a marsupial, Monodelphis domestica, by CRISPR/Cas9 genome editing", por Hiroshi Kiyonari, Mari Kaneko, Takaya Abe, Aki Shiraishi, Riko Yoshimi, Ken-ichi Inoue y Yasuhide Furuta, 21 de julio de 2021, Current Biology.
DOI: 10.1016/j.cub.2021.06.056