Vea También
La realización de pruebas frecuentes y rápidas para detectar el COVID-19 es fundamental para controlar la propagación de los brotes, especialmente a medida que surgen nuevas variantes más transmisibles.
Aunque la prueba de diagnóstico de COVID-19 de referencia actual, que utiliza la qRT-PCR -reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa de la transcriptasa inversa (PCR)- es extremadamente sensible, ya que detecta hasta una copia de ARN por microlitro, requiere un equipo especializado, un tiempo de ejecución de varias horas y una instalación de laboratorio centralizada. Por ello, las pruebas suelen durar al menos uno o dos días.
Un equipo de investigación dirigido por los científicos de los laboratorios de Jennifer Doudna, David Savage y Patrick Hsu en la Universidad de California, Berkeley, tiene como objetivo desarrollar una prueba de diagnóstico mucho más rápida y fácil de implementar que la qRT-PCR. Ahora ha combinado dos tipos diferentes de enzimas CRISPR para crear un ensayo que puede detectar pequeñas cantidades de ARN viral en menos de una hora. Doudna compartió el Premio Nobel de Química 2020 por la invención de la edición del genoma CRISPR-Cas9.
Aunque la nueva técnica aún no está en la fase en la que rivaliza con la sensibilidad de la qRT-PCR, que puede detectar solo unas pocas copias del virus por microlitro de líquido, ya es capaz de captar niveles de ARN viral -unas 30 copias por microlitro- suficientes para ser utilizados para vigilar a la población y limitar la propagación de las infecciones.
"No se necesita la sensibilidad de la PCR para, básicamente, detectar y diagnosticar el COVID-19 en la comunidad, si la prueba es lo suficientemente cómoda y rápida", afirma el coautor David Savage, profesor de biología molecular y celular. "Nuestra esperanza era llevar la bioquímica lo más lejos posible hasta el punto de poder imaginar un formato muy conveniente en un entorno en el que se pueda hacer la prueba todos los días, digamos, a la entrada del trabajo".
Los investigadores comunicaron sus resultados el 5 de agosto de 2021 en la revista Nature Chemical Biology.
 | ||
| Tina Liu y Jennifer Doudna en el exterior del edificio del IGI el día que Doudna ganó el Premio Nobel de Química 2020. Crédito: Foto de la UC Berkeley por Brittany Hosea-Small |
La Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) ha autorizado varios ensayos basados en CRISPR para su uso de emergencia, pero todos requieren un paso inicial en el que se amplifica el ARN viral para que la señal de detección -que implica la liberación de una molécula fluorescente que brilla bajo luz azul- sea lo suficientemente brillante como para poder verla. Aunque esta amplificación inicial aumenta la sensibilidad de la prueba hasta un nivel similar al de la qRT-PCR, también introduce pasos que hacen que la prueba sea más difícil de realizar fuera de un laboratorio.
El equipo dirigido por la UC Berkeley trató de alcanzar una sensibilidad y velocidad útiles sin sacrificar la simplicidad del ensayo.
"Para las aplicaciones en el punto de atención, se quiere tener una respuesta rápida para que la gente pueda saber rápidamente si está infectada o no, antes de subir a un vuelo, por ejemplo, o de ir a visitar a sus familiares", dijo la líder del equipo, Tina Liu, científica investigadora del laboratorio de Doudna en el Instituto de Genómica Innovadora (IGI), un centro centrado en CRISPR en el que participan científicos de la UC Berkeley y la UC San Francisco.
Además de tener un paso añadido, otra desventaja de la amplificación inicial es que, al hacer miles de millones de copias de ARN viral, hay una mayor posibilidad de contaminación cruzada entre las muestras de los pacientes. La nueva técnica desarrollada por el equipo da la vuelta a esta situación y, en su lugar, potencia la señal fluorescente, eliminando una importante fuente de contaminación cruzada.
La técnica sin amplificación, que denominan Detección Rápida Integrada de Nucleasa en Tándem (FIND-IT), podría permitir la realización de pruebas de diagnóstico rápidas y económicas para muchas otras enfermedades infecciosas.
"Aunque iniciamos este proyecto con el propósito expreso de incidir en la COVID-19, creo que esta técnica concreta podría aplicarse a algo más que a esta pandemia porque, en última instancia, CRISPR es programable", dijo Liu. "Así que se podría cargar la enzima CRISPR con una secuencia dirigida al virus de la gripe o al virus del VIH o a cualquier tipo de virus de ARN, y el sistema tiene el potencial de funcionar de la misma manera". Este trabajo establece realmente que esta bioquímica es una forma más sencilla de detectar el ARN y tiene la capacidad de detectar ese ARN en un marco de tiempo sensible y rápido que podría ser susceptible de aplicaciones futuras en el diagnóstico en el punto de atención."
Los investigadores se encuentran actualmente en el proceso de construcción de un diagnóstico de este tipo utilizando FIND-IT, que incluiría los pasos para recoger y procesar las muestras y para ejecutar el ensayo en un dispositivo microfluídico compacto.
Empleo de proteínas Cas en tándem
Para eliminar la amplificación de la diana de la ecuación, el equipo empleó una enzima CRISPR -Cas13- para detectar primero el ARN viral, y otro tipo de proteína Cas, llamada Csm6, para amplificar la señal de fluorescencia.
Cas13 es una tijera de uso general para cortar ARN; una vez que se une a su secuencia objetivo, especificada por un ARN guía, está preparada para cortar una amplia gama de otras moléculas de ARN. Esta actividad de corte desencadenada por la diana puede aprovecharse para asociar la detección de una secuencia específica de ARN a la liberación de una molécula reportera fluorescente. Sin embargo, por sí solo, Cas13 puede necesitar horas para generar una señal detectable cuando hay cantidades muy bajas de ARN objetivo.
La idea de Liu fue utilizar Csm6 para amplificar el efecto de Cas13. La Csm6 es una enzima CRISPR que detecta la presencia de pequeños anillos de ARN y se activa para cortar una amplia gama de moléculas de ARN en las células.
Para potenciar la detección de Cas13, ella y sus colegas diseñaron una molécula activadora especialmente diseñada que se corta cuando Cas13 detecta ARN viral. Un fragmento de esta molécula puede unirse a la Csm6 y activarla para que corte y libere una molécula fluorescente brillante de un trozo de ARN. Normalmente, la molécula activadora es descompuesta rápidamente por la Csm6, lo que limita la cantidad de señal fluorescente que puede generar. Liu y sus colegas idearon una forma de modificar químicamente el activador para que esté protegido de la degradación y pueda sobrecargar la Csm6 para que corte y libere repetidamente moléculas fluorescentes unidas al ARN. El resultado es una sensibilidad 100 veces mayor que la del activador original.
"Cuando Cas13 se activa, escinde este pequeño activador, eliminando un segmento que lo protege", dijo Liu. "Ahora que está liberado, puede activar muchas moléculas diferentes de esa segunda enzima, la Csm6. Así, un objetivo reconocido por Cas13 no sólo conduce a la activación de su propia capacidad de corte de ARN, sino que lleva a la generación de muchas más enzimas activas que pueden escindir cada una de ellas aún más reporteros fluorescentes".
El equipo de investigadores también incorporó una combinación optimizada de ARN guía que permite un reconocimiento más sensible del ARN viral por parte de Cas13. Cuando esto se combinó con Csm6 y su activador, el equipo fue capaz de detectar hasta 31 copias por microlitro de ARN de SARS-CoV-2 en tan sólo 20 minutos.
Los investigadores también añadieron ARN extraído de muestras de pacientes al ensayo FIND-IT en un cartucho de microfluidos, para ver si este ensayo podía adaptarse para funcionar en un dispositivo portátil. Utilizando un pequeño dispositivo con una cámara, pudieron detectar el ARN del SARS-CoV-2 extraído de muestras de pacientes con una sensibilidad que permitiría captar las infecciones por COVID-19 en su punto álgido.
"Este enfoque de nucleasas en tándem -Cas13 más Csm6- combina todo en una sola reacción a una sola temperatura, 37 grados Celsius, por lo que no requiere un calentamiento a alta temperatura ni múltiples pasos, como es necesario para otras técnicas de diagnóstico", dijo Liu. "Creo que esto abre oportunidades para realizar pruebas más rápidas y sencillas que pueden alcanzar una sensibilidad comparable a la de otras técnicas actuales y que podrían alcanzar sensibilidades aún mayores en el futuro".
El desarrollo de este método sin amplificación para la detección del ARN fue el resultado de una reorientación de la investigación dentro del IGI cuando comenzó la pandemia hacia los problemas de diagnóstico y tratamiento de la COVID-19. Finalmente, cinco laboratorios de la UC Berkeley y dos de la UCSF se involucraron en este proyecto de investigación, uno de los muchos que existen dentro del IGI.
"Cuando empezamos esto, teníamos la esperanza de crear algo que alcanzara la paridad con la PCR, pero que no requiriera amplificación; ese sería el sueño", dijo Savage, que fue el investigador principal del proyecto. "Y desde el punto de vista de la sensibilidad, teníamos que saltar una brecha de unas diez mil veces. Lo hemos hecho unas mil veces; lo hemos reducido unos tres órdenes de magnitud. Así que casi lo hemos conseguido. El pasado mes de abril, cuando empezamos a trazar el mapa, parecía casi imposible".
Fuentes, créditos y referencias:
“Accelerated RNA detection using tandem CRISPR nucleases” by Tina Y. Liu, Gavin J. Knott, Dylan C. J. Smock, John J. Desmarais, Sungmin Son, Abdul Bhuiya, Shrutee Jakhanwal, Noam Prywes, Shreeya Agrawal, María Díaz de León Derby, Neil A. Switz, Maxim Armstrong, Andrew R. Harris, Emeric J. Charles, Brittney W. Thornton, Parinaz Fozouni, Jeffrey Shu, Stephanie I. Stephens, G. Renuka Kumar, Chunyu Zhao, Amanda Mok, Anthony T. Iavarone, Arturo M. Escajeda, Roger McIntosh, Shineui Kim, Eli J. Dugan, IGI Testing Consortium, Katherine S. Pollard, Ming X. Tan, Melanie Ott, Daniel A. Fletcher, Liana F. Lareau, Patrick D. Hsu, David F. Savage and Jennifer A. Doudna, 5 August 2021, Nature Chemical Biology.DOI: 10.1038/s41589-021-00842-2
Imagen: Artwork courtesy of Margaret L. Liu, University of Chicago Pritzker School of Medicine